1. Grundlagen Durchflusszytometrie

Was bedeutet Durchflusszytometrie (engl. flow cytometry)?

Flow = Fluid (Durchfluss)

Cyto= Cell (Zyto)

Metry= Measurement (Metrie)

Durchflusszytometrie=Die Durchflusszytometrie, oft auch nicht ganz richtig FACS genannt, ist eine hochsensitive Methode, um einzelne Zellen extrazellulär (auf der Zelle) und intrazellulär (in der Zelle) auf spezifische Marker zu untersuchen (sog. CD-Marker, wie CD4 oder CD8). Die Frage ist dabei: Haben wir es mit Zelle A, B oder C zu tun? Dann kann weiter gegangen und sich bestimmte ähnliche Zellen in sogenannten Populationen angesehen werden. Zum Beispiel: Welche Marker kann man in Population A, B oder C finden? Sind diese Populationen identisch und wie viele Zellen gibt es? Für den Biologen könnten wir auch sagen: Haben wir es mit Lymphozyten, Monozyten oder Granulozyten zu tun? (s. Abbildungen 2 und 3).

Abbildung 1: Schematischer Aufbau eines Durchflusszytometers. Aus: FlowJo https://www.flowjo.com/learn/flowjo-university/flowjo/before-flowjo/58. 

3 Systeme (s. Abbildung 1)

1. Laser - Excitation der Fluorochrome 

Der Laser regt die durch die Flüssigkeit vorbeiströmenden Fluorochrome an, die an den Zellen hängen. Außerdem wird hier bestimmt, wie die Zelle aussieht. Wie viel Inhalt hat die Zelle (Granularität, SSC) und wie groß ist sie (Zellgröße, FSC)?

2. Fluidics - das Flüssigkeitssystem des Durchflusszytometers

Das Flüssigkeitssystem bringt die zu messende Probe vom Probenröhrchen (Tube) über den Laser (4000 Events/s) zum Abfallbehälter.

3. Optisches System

Die Emission der Fluorochrome muss an die richtigen Detektoren gebracht werden (PMTs). Dies geschieht über verschieden Filter und Spiegel.

4. Electronics - die elektronische Einheit, die die rechnerischen Werte in den Dot plot umwandelt (es sichtbar macht am Computer). 

Abbildung 2: Blutzellen nach Lyse der roten Blutkörperchen im SSC-A und FSC-A.

Abbildung 3: Blutzellen nach Lyse der roten Blutkörperchen im SSC-A und FSC-A (Gating).

Abbildung 4: Lymphozyten gefärbt mit CD3 APCeFluor780 (Kanal APC-Cy7).

Abbildung 5: Mit Antikörpern und daran hängenden Fluorochromen gefärbte Immunzellen (CD3+ Zellen aus Abbildung 4). Es sind zwei Subpopulationen erkennbar: CD4+-T-Helferzellen links oben und CD8+-Zytotoxische T-Zellen rechts unten.

Fluorochrome=Ein Stoff, der häufig an einem Antikörper hängt ist und durch den Laser des Durchflussytometers angeregt wird, Licht zu erzeugen (vereinfacht gesagt eine Farbe). Es gibt verschiedene Farben in der Durchflusszytometrie von sehr kurzwelligem (z. B. UV-Licht) zu langwelligem Licht (z. B. Rotlicht). Der Laser regt die Elektronen im Fluorochrom an, dass sie nach oben schießen (höheres Energielevel) und beim Runterkommen Licht erzeugen, das wiederum vom Durchflusszytometer gemessen werden kann. 

Dot plot=Jeder Punkt auf dem Bildschirm ist ein Dot (Punkt). Alles zusammengenommen ist ein Dot plot. Da aber, wie beim Blut nicht immer alles so schön aufgetrennt werden kann, ist es nötig, mit Antikörpern zu färben, an denen Fluorochrome (s. oben) hängen. So kann dann gezeigt werden, dass es einen Teil der Zellen gibt, die Immunzellen sind (CD3+). Aber es gibt hier auch viele Zellen, die keine Immunzellen, sondern andere Zellen sind (CD3-).

Gating=Hier kommt dann das Gate ins Spiel. Man kann ein Gate auf Zellen richten, die man sich anschauen will. Und zwar nur diese Zellen. In Abbildung 4 wurde ein Gate nur auf CD3+-Zellen gelegt, weil der Fokus auf den Immunzellen liegt, die eben CD3 auf ihrer Oberfläche tragen. Und danach wurden die Zellen untersucht, die neben CD3 auch CD4 (CD4+-T-Helferzellen) und CD8 (Zytotoxische T-Zellen) auf ihrer Oberfläche tragen. In Abbildung 5 wurden vier Fälle beschrieben. Dabei handelt es sich zum einen über Zellen, die nur CD4 tragen (CD4+CD8-, oben links), Zellen, die beides tragen (CD4+CD8+, oben rechts), Zellen, die keinen Marker tragen CD4-CD8-, unten links) und Zellen, die nur CD8 tragen (CD4-CD8+, unten rechts).

Density plot=Ein Density plot ist auch ein Dot plot, weil jeder einzelne Punkt auf der Grafik repräsentiert ist, aber es unterschiedliche Farben gibt, die die Dichte an Punkten (respektive Zellen) darstellen. Eine hohe Dichte an Zellen wird mit der Farbe rot gekennzeichnet, wohingegen eine Region mit wenigen Zellen blau erscheint. Dies kann man gut in Abbildung 2 und 3 erkennen. Im ersten Plot, im sogenannten FSC/SSC-Plot ist aber nicht immer klar, ob die Dichte an Zellen auch die Dichte an Populationen (also gleichen Zellen) darstellt. Dies gestaltet sich zum Beispiel bei Epithelzellen schwieriger. Epithelzellen bilden nämlich keine einheitliche Population in Größe und Granularität, wie es zum Beispiel die Blutzellen (Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen, Granulozyten) tun. Der Forward Scatter und Side Scatter wird im Nachfolgenden beschrieben:

Forward Scatter (FSC)=Zellgröße; je höher der FSC, desto größer die Zelle, z. B. sind Granulozyten größer als Lymphozyten oder rote Blutkörperchen.

Side Scatter (SSC)=Komplexität der Zelle, auch Granularität, z. B. Granulozyten (wie der Name schon sagt). Je granulärer die Zelle ist, desto weiter oben befindet sie sich. 

Beim Blut kann man diese Verteilung sehr schön sehen: Weniger granuläre und kleinere Zellen befinden sich weiter links, während sich größere und granuläre Zellen weiter rechts im Dot plot befinden. Was ein Dot plot ist, wissen wir ja jetzt :-)