Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (auch Polymerase Chain Reaction (PCR)) wurde 1983 von Kary Mullis entwickelt. Ihm wurde dafür 10 Jahre später der Nobelpreis für Chemie verliehen. Dieses Verfahren der Molekularbiologie wird für den Nachweis von jeder bekannten Nukleinsäure, also der Erbsubstanz, verwendet. Ob diese Erbsubstanz jedoch von replikationsfähigen Mikroorganismen stammt, weist die PCR nicht nach. Um bestimmte Nukleinsäuren in einer Probe nachzuweisen, wird eine große Menge davon benötigt. Die PCR vervielfältigt auch kleinste Schnipsel an Desoxyribonukleinsäure (DNA) sowie Ribonukleinsäure (RNA). Je mehr vervielfältigte DNA oder RNA vorhanden ist, desto besser gelingt später der Nachweis eines Mikroorganismus. Dabei wird aber nicht das ganze Genom, sondern nur ein kleiner Ausschnitt davon, etwa ein Gen, vervielfältigt.

DNA=Erbsubstanz von Eukaryoten, die sich im Zellkern befindet. DNA lässt sich aber auch in Bakterien (Prokaryoten) finden. Hier befindet sich die DNA nicht in einem Zellkern. Die DNA besteht aus vier Basen, von denen je zwei zusammenpassen. Guanin paart mit Cytosin, Thymin mit Adenin. Die Abfolge der Basen ist von Lebewesen zu Lebewesen, von Spezies zu Spezies und sogar von Mensch zu Mensch unterschiedlich. DNA ist doppelsträngig, d. h. Guanin und Cytosin sowie Thymin und Adenin sind jeweils verbunden und bilden chemisch Wasserstoffbrückenbindungen miteinander aus.

Gen=eine bestimmte Abfolge an Basen in einem Organismus. Gene führen meist, aber nicht immer, zu Protein.

Genom=Gesamtheit aller Gene eines Organismus.

Die PCR muss in verschiedenen Schritten ablaufen, damit sie die gesuchten Gene vervielfältigen kann. 1. Denaturierung, 2. Anlagerung, 3. Elongation. 

Beim ersten Schritt (Denaturierung) wird die doppelsträngige DNA in zwei einzelsträngige Stücke durch starke Hitze aufgetrennt. Dies ist wichtig, da die Primer sich vor das Gen anlagern müssen, das vervielfältigt werden soll, schließlich soll nur das eine Gen nachgewiesen werden.

Primer=ein vor dem zu vervielfältigenden Gen festgelegte Basenabfolge, die einzelsträngig ist. Sie lagert sich vor den Bereich des Gens an und legt damit den Beginn und die Grenze des zu vervielfältigenden Gens fest.

Nach der Denaturierungsphase, beginnen sich die Primer bei niedrigerer Temperatur anzulagern (Anlagerungsphase). Bei weniger Wärmeeinwirkung bilden sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen Cytosin und Guanin, Thymin und Adenin leichter aus.

Abbildung 1: Die Abbildung zeigt die drei Phasen der PCR: Denaturierung, Anlagerung der Primer und Elongation und die daraus entstehende, sich vervielfältigende Menge an DNA-Abschnitt. Enzoklop / CC BY-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0). https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Polymerase_chain_reaction.svg 

Danach beginnt eine Polymerase bei etwa 72 Grad Celsius, die aufgetrennte, nun einzelsträngige DNA zu komplementieren. Dies geschieht zwischen den beiden Primern - und nur hier (Elongationsphase).

Polymerase=ein Protein, genauer ein Enzym, das in der Lage ist, die jeweiligen Basen richtig zu verbinden. Alle Enzyme enden in der Nomenklatur mit -ase. 

Sobald die Polymerase die Basen vervollständigt hat, beginnt der Zyklus erneut am Punkt der Denaturierung. Dies kann 30-40 Mal wiederholt werden, bis genug vervielfältigtes Gen vorhanden ist, um es mit einer Gelelektrophorese nachzuweisen.

Gelelektrophorese=Nachweisverfahren für DNA und Produkte der PCR (Gene) mit bekannter Länge. Eine Basenpaarung wird als ein bp (base pair) bezeichnet.

Die PCR ist also in der Lage, kleinste Mengen an DNA oder RNA nachzuweisen, sie weist allerdings nicht nach, ob die gefundenen Mikroorganismen noch infektiös sind. Sie sind aber spezifisch für den Mikroorganismus. Je geringer die Anzahl an Zyklen sind, die gebraucht werden, um das Gen nachzuweisen, desto höher ist die Menge an vorhandenem Gen zu Beginn. Je mehr Zyklen gebraucht werden, desto geringer ist die Menge an Gen zu Beginn (Ct-Wert). 

Ct-Wert=Cycle-threshold-Wert; Je höher der Ct-Wert, desto geringer ist die Konzentration an Erbsubstanz in der Probe. Je geringer der Ct-Wert ist, desto größer ist die Konzentration an Erbsubstanz in der Probe zu Beginn. Werte über 30 weisen auf eine geringe, Wert über 35 auf eine sehr geringe DNA-Konzentration in der untersuchten Probe hin.

Abbildung 2: Nachweis eines des CCR5-Gens mittels PCR und anschließender Gelelektrophorese. Gezeigt ist hier die Gelelektrophorese des Gens für den Co-Rezeptor von HIV der menschlichen Zelle: CCR5. Probe 1 zeigt zwei schwache Bande, d. h. die Person ist für dieses Merkmal heterozygot. Probe 2 zeigt nur eine Bande, d. h. die Person ist homozygot für dieses Merkmal. Die Kontrollen sind gezeigt, um zu beweisen, dass die PCR funktioniert hat (homozygote Wildtyp-Kontrolle, heterozygote Kontrolle, homozygote Kontrolle, Wasser-Kontrolle (Negativkontrolle)). Bei Menschen ohne funktionstüchtigen CCR5-Rezeptor wird die Zelle nicht mit HIV infiziert. Die Person hat aber ein erhöhtes Risiko an Krebs zu erkranken (https://www.aerzteblatt.de/nachrichten/103574/CCR5-Mutation-schuetzt-vor-HIV-und-verkuerzt-die-Lebenszeit).